氢气透析液的血透影响能量代谢改善透析研究疲困

摘记

有研究报说念，经受水电解产生的富氢气（H₂）透析液的血液透析（E - HD）可缓解透析研究疲困，但其与代谢气象的关联仍不解确。81名接受模范血液透析（HD）的患者被分为3组 [A组（n = 25，30.9%）：伴有行径减少的疲困—— 亚组A1：慢性抓续性疲困（n = 11），A2：仅在透析日出现疲困（n = 14）；B组：无行径减少的疲困（n = 24，29.6%）；C组（n = 32，39.5%）：无疲困]，并对他们在接受E - HD诊治12个月后的疲困气象、身段要素和代谢气象变化进行了研究。各组患者的基线特征无权贵各异。在开动E - HD诊治后的12个月里，A组患者的疲困感权贵缩小，而B组和C组无变化。生物电阻抗分析炫耀，A1组无权贵变化，但A2组尽管体重无权贵变化，体脂却权贵减少，骨骼肌量权贵加多。富集分析标明，A组和C组在基线时，脂肪酸代谢、柠檬酸轮回和糖酵解等代谢道路存在权贵各异，而E - HD缩小了这些各异。E - HD可能通过改变患者的能量代谢来摆布透析研究疲困。E - HD可能代表了一种卓越传统基于溶质打消的透析疗法的尿毒症诊治新范式。

小序张开剩余95%

疲困被合计是透析患者一项要道的自我弘扬成果[1 - 3]。疲困不仅影响日常行径，还因食欲和身段行径减少，被视为养分不良和软弱的一个风险因素[4]。此外，疲困已被确定为患者预后的一个零丁预测因素[5 - 8]，这标明疲困症状可能变成一个无益的轮回。因此，了解透析研究疲困的病理生理学机制并制定灵验的诊治战略，是医学上头对的紧要挑战。

临床上，疲困症状可能在血液透析（HD）开动时出现，主不雅症状大多局限于透析日，也可能不论是否透析皆抓续存在[8]。然则，当今尚不了了它们是否属于不同的情况。对于透析疲困的病理生理学存在很多不确定性。尿毒症、养分、贫血和日用品等因素[9]，以及HD系统研究问题，如生物相容性研究的氧化应激[10 - 11]，包括铁剂的使用[12]，皆可能导致疲困的发生。血液透析系统中的生物相容性问题仍未得到措置。血液与透析成立的斗争会刺激白细胞、血小板和补体激活，导致炎症细胞因子开释、血小板结合、中性粒细胞脱颗粒（如髓过氧化物酶开释）和中性粒细胞胞外罗网的变成[13 - 15]。当今，尚窝囊够填塞摆布这些反应的诊治系统。

氢气（H₂）具有生物效应，如打消线粒体中的活性氧，并通过主要的氧化还原更动因子NF - E2研究因子2（Nrf2）激活平凡的抗炎和抗氧化系统[16 - 23]。基于H₂的抗氧化和抗炎特质，咱们开拓了电解水血液透析（E - HD），即在透析液中添加H₂以普及生物相容性[24 - 26]。研究标明，E - HD可镌汰HD诊治技能的氧化应激[27]，并通过抓续诊治创新患者的基础氧化还原状态[28]。此外，咱们的研究团队已零丁报说念，接受E - HD诊治的患者疲困感得到缓解[29 - 32]。这些不雅察成果标明，生物相容性对透析研究疲困发展的影响可能很大。然则，通过H₂改善生物相容性从而在临床上摆布疲困的机制仍知之甚少。

因此，本研究旨在对E - HD诊治技能的疲困进行永恒评估，并从身段代谢的角度研究疲困的变化过甚机制。

成果

1. 疲困评估及按疲困程度对患者分组（图1）

图1 模范血液透析 M0 的患者分组。

- 通过对受试者使命特征（ROC）弧线的分析，确定数字评重量表（NRS）评分≥4为存在显明疲困的临界值，在本研究中，透析日原始疲困量表3级或4级被界说为伴有日常生涯行径（ADL）减少的疲困（NRS = 3.75：明锐性0.909，特异性0.764；NRS = 4.5：明锐性0.909，特异性0.833）。相通，NRS = 0或1在本研究中被界说为无疲困（NRS = 1.5：明锐性0.936，特异性0.806；NRS = 2.25：明锐性0.851，特异性0.861对应1级）。凭证成果，患者被分为3组：A组（NRS为4或更高界说为伴有ADL减少的疲困：n = 25，30.9%），B组（NRS为2或3界说为无ADL减少的疲困：n = 24，29.6%），C组（NRS为0或1界说为无疲困：n = 32，39.5%）。此外，A组又细分为两种类型：A1组，透析日和非透析日均有慢性抓续性疲困（NRS 4或更高）（n = 11）；A2组，仅在透析日有疲困（n = 14）。

2. 基线时按疲困程度差异的患者东说念主口统计学特征及12个月不雅察期内疲困水平的变化

- 96名患者中有92例得回了本研究的知情应允，而后对他们进行了12个月的随访。在此技能，6名患者因就医便利转至其他诊所，2名患者因严重肺炎死亡（1例为新冠病毒感染，1例为社区得回性肺炎），3名患者因在研究技能对问卷反馈欠安而退出（1例因永恒入院，2例因不衔尾拜谒）。最终，81例患者完成了12个月的拜谒。对这81名患者的数据进行分析（男性60例；74.1%，平均年岁71.4岁，平均透析时长10.6年）。

- 各组患者的特征见表1。3组患者在透析日NRS、非透析日NRS、年岁方面存在权贵各异，其他方面未发现权贵各异。

- 通过游离DNA（cfDNA）和髓过氧化物酶与DNA复合物（MPO - DNA）水平来研究当作生物相容性记号物的中性粒细胞胞外罗网（NETosis）表象，但在基线（表1）或随访6个月、12个月时，各组均未发现权贵各异；A组cfDNA（单元）：6个月时为3.70 ± 0.75，12个月时为3.83 ± 0.91；B组6个月时为3.46 ± 0.90，12个月时为3.57 ± 0.95；C组6个月时为3.67 ± 0.99，12个月时为3.72 ± 1.11。A组MPO - DNA（单元）：6个月时为2.86 ± 1.89，12个月时为2.82 ± 1.74；B组6个月时为2.59 ± 1.23，12个月时为3.01 ± 1.49；C组6个月时为2.44 ± 1.10，12个月时为2.64 ± 1.31。

表 1 基线（第 0 个月）按疲困等第差异的患者特征。

表 2 A 组亚组的患者特征：基线（第 0 个月）和不雅察放胆（第 12 个月）。

- 表2炫耀了A组亚组患者的特征。A1和A2在基线（M0）时骨骼肌量存在权贵各异，A2在M0和M12之间的脂肪量、骨骼肌量和细胞外液与总体液百分比（ECV/TBW%）存在权贵各异。

图2 12个月内透析日和非透析日NRS的变化。

- 图2a和图2b分别炫耀了12个月内透析日和非透析日NRS的变化。A组透析日NRS权贵下落，而非透析日未不雅察到统计学变化。B组和C组在透析日和非透析日均未发现权贵变化。

- 对于A1组和A2组，与M0基线比较，A1组和A2组在M12时透析日和非透析日的NRS均权贵下落。除A1组骨骼肌量权贵较低外，基线参数无其他各异。在M12时，与M0比较，A2组脂肪量权贵减少，骨骼肌量权贵加多，其他参数无权贵变化。

- A组NRS的统计成果存在各异（即通过重复测量方差分析，A组非透析日从M0到M12的NRS无统计学各异，而通过配对t教育，A1和A2亚组M0和M12之间NRS权贵下落）。对于原因，咱们合计样本量小以及A2组M12数据的非正态分散（存在极度值）可能导致了这一令东说念主困惑的成果。A组（A1和A2）的亚组分析呈现出与图2b疏通的趋势。

3. 用于代谢组分析的患者样本集及尿毒症毒素的测量（图3）

- 对从A组和C组抽取的35名患者进行代谢组分析和尿毒症毒素测量，以比较疲困患者和非疲困患者之间，以及模范HD（S - HD）的M0和E - HD的M12之间的各异。对于患者样本集，S - HD（M0）时的疲困组和非疲困组界说为“疲困 - S（FS）”，E - HD（M12）时界说为“疲困 - E（FE）”，通盘患者在S - HD（M0）和E - HD（M12）之间的比较界说为“EHD”。千般本集患者数目细目见图3。

图3千般本集患者数目.

图4 .170种个体代谢物概述。

4. 空洞代谢组学分析及E - HD对透析疲困的可能影响

- 通过非靶向代谢组学分析检测到170种个体代谢物，富集代谢物集（前25位）的概述分别见图4a（患者样本集：FS）、图5a（患者样本集：EHD）和图6a（患者样本集：FE）。各组间几种代谢物存在权贵变化。3个患者样本荟萃每种代谢物的权贵变化细目分别见图4b、图5b和图6b。

图5多样代谢物的权贵变化

图6多样代谢物的权贵变化

- 图7炫耀了各患者样本集富集代谢物集之间相互关系的转头。FS和EHD有16个共同的代谢物集，FS和FE有12个共同的代谢物集。在FS和EHD的共同代谢物荟萃，8个代谢物集与不与FE叠加的代谢物疏通（道路A），8个与FS和FE疏通（道路B）。图8展示了E - HD改变的代谢道路要道候选者的默示图。

图7各患者样本集富集代谢物集之间相互关系。

图8展示了E - HD改变的代谢道路要道候选者的默示图。

5. 尿毒症毒素浓度（表3、表4）

- 基线（M0）时，疲困组和非疲困组血清中尿毒症毒素浓度无权贵各异（患者样本集：FS）。在M0和M12的总体比较中（患者样本集：EHD），马尿酸、对甲酚硫酸盐、乙二醛和3 - 脱氧葡萄糖醛酮无权贵变化，而M12时硫酸吲哚酚和甲基乙二醛权贵下落。

磋商

已有研究报说念E - HD可改善透析研究疲困[29 - 32]。本研究评估了疲困的永恒变化，并在引入E - HD后研究了代谢气象和尿毒症毒素，以探索其抗疲困作用背后的机制。在模范HD技能履历伴有行径减少的疲困的患者，在12个月内疲困感权贵改善。其中，仅在透析日出现疲困的患者，体脂肪量权贵减少，而骨骼肌量权贵加多。代谢组分析炫耀，基线时疲困组和非疲困组在能量代谢方面存在权贵各异，12个月时E - HD缩小了这些各异。两组在基线时尿毒症毒素谱无权贵各异，但E - HD 12个月后硫酸吲哚酚和甲基乙二醛水平权贵下落。

在本研究中，咱们基于临床上它们可能是不怜悯况的假定，将A组患者分为两个亚组，即在透析日和非透析日均有抓续性疲困的患者（A1组），以及仅在透析日有疲困的患者（A2组）。

两组之间，基础疲困水祥和基础骨骼肌量存在各异。此外，两组间身段要素的变化（即M0与M12的脂肪量、骨骼肌量和ECV/TBW）也不同。这些数据可能复古咱们的不雅点。然则，两组在M12时与M0比较，透析日疲困均权贵下落。此外，A1组非透析日疲困权贵下落（M0与M12比较），A1组和A2组在M12时无统计学各异。基于这些成果，咱们测度E - HD可能摆布了与HD研究的疲困病理因素，从而改善了A1组过度的疲困。这些成果可能标明两组之间存在共同的病理机制。空洞这些成果，咱们假定的灵验性仍有待考证，需要进一步研究来得出论断。

透析患者疲困的病理生理学在很大程度上仍不了了。在本研究中，咱们凭证NRS疲困水平将HD患者分为3组。对于患者特征，疲困患者（A组）年岁较大，女性居多。但除此除外，在医学布景、身段要素和实验室数据（如血红卵白、血白净卵白和C反应卵白）方面未发现各异。通过cfDNA和MPO - DNA水平研究当作生物相容性记号物的中性粒细胞胞外罗网表象，但在基线或随访技能未发现权贵各异。然则，代谢组分析成果标明，基线（M0）时疲困组和非疲困组（患者样本集：FS）在代谢谱方面存在权贵各异，包括能量代谢道路。与非疲困组比较，疲困组脂肪酸代谢和糖酵解相对增强，而在柠檬酸轮回中，尽管柠檬酸和异柠檬酸水平较高，但琥珀酸权贵镌汰，标明异柠檬酸之后的代谢存在阻断。这标明能量代谢的潜在繁芜可能与透析研究疲困联系。风趣的是，在伴有疲困和窘迫的疾病中，如肌痛性脑脊髓炎/慢性疲困空洞征[33 - 34]、系统性红斑狼疮[35]、法布里病[36]和癌症[37]，均有能量代谢繁芜的报说念。透析患者的疲困可能与这些疾病存在病理同源性。

从S - HD窜改为E - HD后，先前研究报说念了自主神经均衡的归附[30]、氧化应激的摆布以及抗氧化剂耗竭的驻防[31]。本研究标明，在S - HD和E - HD时，疲困组和非疲困组的代谢谱存在各异，此外，S - HD和E - HD之间也存在各异（图4a、图5a和图6a）。

如图7转头，凭证富集分析成果，咱们测度了4个可能影响疲困发展的道路组，即被E - HD创新的疲困研究因素（道路A）、可能受E - HD影响的因素（道路B）、不受E - HD影响的疲困病理常见事件（道路C）以及填塞不受E - HD影响的因素（道路D）。被E - HD创新的道路A包括能量代谢，如脂肪酸合成/降解、糖酵解/糖异生和二羧酸代谢——可能触及多元醇道路。另一方面，柠檬酸轮回被合计是一个可能受E - HD影响但未得到充分创新的疲困研究因素（道路B）。基于这些成果，咱们测度E - HD可通过干与糖酵解、脂肪酸代谢和柠檬酸轮回来改善透析研究疲困。图8转头了可能被E - HD改变的中心代谢道路；在S - HD中相对增强的代谢道路，即糖酵解和脂肪酸代谢，在E - HD中可能受到摆布，而在S - HD中相对摆布的柠檬酸轮回，在E - HD中可能得到改善。此外，与S - HD比较，E - HD中谷胱甘肽合成可能更易进行。

对于柠檬酸轮回功能阻隔，似乎琥珀酸前体琥珀酰辅酶A和α - 酮戊二酸的变成不及可能与该机制联系（图8）。对于前者，不成排斥肠说念微生物群产生的短链脂肪酸丙酸供应不及可能参与其中。在S - HD和E - HD的比较中（患者样本集：EHD），丙酸代谢存在权贵各异，且在E - HD中不雅察到源自α - 酮戊二酸的脯氨酸和鸟氨酸水平较高，这标明E - HD归附了柠檬酸轮回功能。此外，在E - HD时疲困组和非疲困组的比较中（患者样本集：FE），糖酵解和脂肪酸代谢未被确定为权贵因素。空洞这些成果，对于透析研究疲困的机制，咱们测度如其他场地所报说念[38]，在 mitochondrial 功能受损的状态下，糖酵解和脂肪酸合成可能至少部分增强，当作ATP生成的赔偿机制。咱们测度E - HD可能影响了疲困患者的线粒体功能，因为多数弘扬标明H₂通过部分摆布氧化应激对线粒体具有保护作用[39 - 40]。最近有报说念称棕榈酸通过线粒体毁伤在脂毒性心肌细胞毁伤中起中枢作用[41]。风趣的是，在本研究中，S - HD疲困组中不雅察到棕榈酸权贵加多，而E - HD使其改善，这可能标明E - HD如其他场地所报说念[42]，对腹黑具有保护作用。

此外，与M0比较，M12时焦谷氨酸的减少可能标明引入E - HD后谷胱甘肽代谢的归附。这可能意味着E - HD不错普及抗氧化智力或减少氧化应激刺激，防护抗氧化剂耗竭，如其他场地所报说念[27, 30]。改善的能量代谢和抗氧化智力可能有助于临床疲困的缩小，同期A2组出现养分改善，即引入E - HD后肌肉量加多，这标明患者从阐述代谢环境升沉为合成代谢状态。然则，这些经过之间的相互关系仍然是假定性的，邻接这种病理生理学依然将来的一个挑战。

风趣的是，在E - HD（患者组：FE）中，疲困组和非疲困组之间的富集代谢物集与S - HD（患者组：FS）时不同，而况发现了包括养分元素研究的因素，如牛磺酸和支链氨基酸（缬氨酸、亮氨酸）的代谢。咱们测度，在E - HD改善能量和氧化还原状态后，这些与疲困研究的因素才得以流露。对于养分问题，有研究报说念，血液透析（HD）患者血浆中的支链氨基酸水平低于健康受试者 ，同期其水平与HD患者的疲困程度呈正研究 。在天职析中，不论经受何种HD样式，疲困组中的缬氨酸和亮氨酸水平络续较高，这可能反馈出由于肌肉量减少，疲困患者体内支链氨基酸的肌肉代谢延长 。牛磺酸是一种具有抗氧化特质的非必需氨基酸，可从海鲜等膳食起头中给与。据报说念，其在HD患者体内的较高水平与较低的疲困程度研究 。基于该报说念和本研究成果，考证疲困患者是否能从包括补充牛磺酸在内的养分复古中获益，是一项临床挑战。

在基线时（患者组：FS），疲困患者和非疲困患者的尿毒症毒素谱未发现各异。然则，对通盘患者进行比较后发现，硫酸吲哚酚和甲基乙二醛这两种氧化应激指引物 在E - HD诊治12个月后权贵减少。

硫酸吲哚酚由肠说念内色氨酸代谢产生，随后在肝脏中进一步代谢，它是一种与卵白质结合的尿毒症毒素，难以通过透析打消 。因此，E - HD能权贵镌汰该分子的水平，这在临床上值得热心。由于色氨酸过甚肠说念代谢居品色胺和吲哚乙酸的水平保抓不变（数据未炫耀），对于硫酸吲哚酚的减少，可能存在几种机制，即摆布肠说念细胞中吲哚的产生、减少体内硫酸吲哚酚的生成，或者如其他研究所示，E - HD加多了其打消率 。研讨到E - HD可能改变肠说念微生物群产生短链脂肪酸（丙酸）的情况，HD经过中的H₂负荷是否会影响菌群失调，依然将来研究的一个课题。

甲基乙二醛是在糖酵解和多元醇道路增强经过中产生的一种尿毒症毒素，会指引氧化应激 。近期弘扬标明，甲基乙二醛可导致肌肉祖细胞中的线粒体毁伤，进而引发尿毒症肌少症 。疲困组骨骼肌量有镌汰的趋势，这突显了甲基乙二醛减少的临床真义。

本研究存在一些局限性，包括经受单臂不雅察性想象，对代谢组分析的解说是基于假定而非径直数据，而况无法排斥研究技能外部因素或患者里面模范变化对疲困评估的影响。此外，由于病例数目有限，本研究无法难得评估A1组和A2组之间的各异，咱们合计在慢性疲困类型中，形态因素可能会产生影响 。

尽管如斯，咱们合计本研究标明E - HD可能通过影响能量代谢以及潜在的抗氧化代谢来缓解疲困。然则，E - HD影响这些代谢系统的真确机制仍不了了。近期研究标明，H₂可径直影响线粒体功能 ，并指引Nrf2抒发 ，从而更动机体的氧化还原系统。探究电解水中所含的H₂是否通过激活Nrf2来改善线粒体功能并增强举座抗氧化系统，依然将来的一项要道挑战。

总之，E - HD似乎或者摆布透析研究疲困。其机制可能触及能量代谢和抗氧化系统的改变，以及与氧化应激研究的尿毒症毒素的减少。E - HD当作一种新式的尿毒症诊治方法，通过更动机体代谢，卓越了传统基于溶质打消的透析疗法。

方法

患者

本前瞻性不雅察研究的参与者为2020年10月至2021年9月技能在日本东京圣路加国外病院门诊接受老例透析诊治的患者。通盘患者均按时接受模范HD诊治，每周三次，每次4 - 5小时，使用高性能膜透析器（膜材料：聚砜、聚醚砜、聚甲基丙烯酸甲酯和三醋酸纤维素）。自2020年10月第一周起，门诊通盘患者开动接受E - HD诊治，并在而后按时进行。窜改为E - HD诊治无任何禁忌症，除透析液改变外，透析决策无任何变化。邀请通盘门诊HD患者（n = 96）参与本研究。96名患者中有92例得回了本研究的知情应允，而后对他们进行12个月的随访。在此技能，6名患者因就医便利转至其他诊所，2名患者因严重肺炎死亡（1例为COVID - 19感染，1例为社区得回性肺炎），3名患者因在研究技能对问卷反馈欠安而退出（1例因永恒入院，2例因不衔尾拜谒）。最终，81例患者完成了12个月的拜谒。对这81名患者（60名男性；占74.1%，平均年岁71.4岁，平均HD透析时长10.6年）的数据进行分析。

本研究决策已得回圣路加国外病院伦理审查委员会的全面批准（批准日历：2019年6月19日；研究编号：18 - RZ013）。通盘方法均按照研究指南和设施实行。

疲困评估

如其他文件报说念 ，本研究使用数字评重量表（NRS）和咱们自行想象的原始疲困量表对患者疲困进行评估。通盘问卷均经受书面形态。NRS是一种一维量表，左端泄露“填塞不累（0）”，右端泄露“终点窘迫（10）”。咱们的原始疲困量表是患者的四级自我评揣度表：1级（无疲困），患者行径如常，无任何疲困感；2级（轻度疲困），患者行径如常，但嗅觉疲困；3级（中度疲困），患者即使从事轻度使命也会感到疲困；4级（重度疲困），患者嗅觉至极疲困并入睡。因此，瞻望1级和2级患者的日常生涯行径（ADL）或者督察，而3级和4级患者的ADL会大幅下落。

通盘患者在模范HD技能的第一个时刻点，即在开动EHD系统前2周内（M0），使用问卷进行疲困评估，问卷问题为“你在之前的透析日以及透析后第二天嗅觉有多疲困？”。在开动E - HD系统后的第1个月（M1）、第3个月（M3）、第6个月（M6）和第12个月（M12），反复磋商NRS（透析日和非透析日）。在每个时刻段的特定一周内，立时选用一个透析日，在HD开动前进行疲困评估。

E - HD系统概述

简而言之，E - HD溶液的制备经过如下：自来水供应至电解水 - 血液透析系统（日本大阪Trim Medical Institute Co.），在该系统中，水经度日性炭过滤和软化处理，然后通过曙光极和阴极电极板供应直流电进行电解。阳极一侧的水被排出，阴极一侧的水（电解水）被汇集起来供应给反渗入模块。电解强度被调整至筹画H₂浓度。由电解水 - 血液透析系统产生的含H₂反渗入水被用于制备HD溶液。流入的E - HD溶液要素与CHD使用的透析溶液疏通，不同之处在于E - HD中含有融解的H₂，而电解质水平或pH值无各异。透析液中的H₂水平在70 - 130 ppb边界内。使用DH Meter（DH - 35A；日本东京DKK - TOA公司）测量HD溶液中融解的H₂量。

测量

在基线期（M0）以及研究技能的测试点（1个月（M1）、3个月（3M）、6个月（6M）、12个月（12M）），在HD诊治前后从通盘患者处采集血样。采样前患者可宽泛进食。血样用乙二胺四乙酸离心处理，通盘样本均储存于 - 80℃，直至需要测量时取出。

对M0和M12的血浆样本（A1组，n = 11；A2组，n = 12，C组，n = 12）进行尿毒症毒素和羰基化合物的测量以及代谢组分析。在A2组中，有2例因样本不及未进行测量，在C组中，从32例中立时选用12个样本。

NETosis的记号物

径直在生物体液中检测游离DNA。最初将SYBR Gold核酸凝胶染色剂（好意思国Invitrogen公司）在二甲基亚砜（好意思国Sigma - Aldrich公司）中按1:1000稀释，然后在磷酸盐缓冲盐水（以色列Beth Haemek的Biological Industries公司）中按1:8稀释。将20 μL DNA模范溶液（好意思国Sigma - Aldrich公司）和测试样品分别加入玄色96孔板（德国Greiner Bio - One公司）中。向每个孔中加入40 μL上述制备的SYBR Gold溶液（最终稀释度1:10,000），使用96孔荧光计（好意思国PerkinElmer公司）在辐射波长535 nm和引发波长485 nm下测量荧光。

为检测NET，参考Lood的弘扬 进行以下才略以测量髓过氧化物酶（MPO）和DNA复合物（MPO - DNA）。将96孔微量滴定板（Corning公司）用小鼠单克隆抗MPO抗体（4 μg/ml，Biorad公司，克隆4A4）在4℃下包被过夜，然后用1%牛血白净卵白的磷酸盐缓冲盐水在室温下闭塞2小时。闭塞后，加入血浆样本（10%）并在4℃下孵育过夜。为进行检测，加入抗双链DNA - 辣根过氧化物酶抗体（稀释1/100，Roche Diagnostics公司），在室温下孵育2小时。用3,3′,5,5′ - 四甲基联苯胺（BD Biosciences公司）显色反应，加入2 N硫酸远隔反应。使用酶标仪（Synergy，BioTek公司）在450 nm处测量吸光度。分离的NETs用作模范弧线，1 U/ml至极于10,000个中性粒细胞开释的NET。

血浆代谢物

经受基于代谢组学方法的气相色谱 - 质谱联用仪（GC - MS）测量血浆代谢物水平。将50 μL血浆与250 μL含有55%甲醇和22%氯仿的溶液搀和，该溶液融解于含有0.5 mg/mL 2 - 异丙基苹果酸（好意思国Sigma - Aldrich公司）的蒸馏水中。然后，将样品在ThermoMixer C（Eppendorf公司）中于37℃、1200 rpm回荡孵育30分钟。样品在4℃、16,000 × g下离心3分钟。汇集200 μL上清液，并加入200 μL蒸馏水。样品在4℃、16,000 × g下再次离心3分钟。取250 μL上清液，使用挥发器在减压下干燥并冻干。将80 μL融解于吡啶中的20 mg/mL甲氧胺盐酸盐（好意思国Sigma - Aldrich公司）与冻干样品搀和，超声处理20分钟，并在30℃、1200 rpm下回荡90分钟。接下来，加入40 μL N - 甲基 - N - 三甲基硅基 - 三氟乙酰胺（MSTFA）（日本东京GL Sciences公司）进行生息化。搀和物在37℃、1200 rpm下搀和30分钟，在4℃、16,000 × g下离心5分钟，取1 μL所得上清液进行GC - MS分析。GC - MS分析使用GC - MS QP2010 Ultra（日本岛津公司），配备熔融石英毛细管柱（BPX - 5；30 m × 0.25 mm内径，膜厚：0.25 μm；日本岛津公司），进样口前端温度为250℃，氦气通过柱子的流速为39.0 cm/秒。柱温在60℃保抓2分钟，然后以15℃/分钟的速率升至330℃，并保抓3分钟。接口和离子源温度分别为280℃和200℃。所迥殊据通过GC - MS分析得回。使用Smart Metabolites Database（日本岛津公司）中指令的保留时刻。为进行半定量评估，打算每个定量离子的峰面积，并使用2 - 异丙基苹果酸峰面积进行归一化。

尿毒症毒素

为测量尿毒症毒素进行样品制备时，将75 μL含有1.25 μg/mL硫酸吲哚酚 - d3和2.5 μg/mL马尿酸 - d5的0.1%甲酸甲醇加入到25 μL每份血浆中，涡旋数秒。然后，样品超声处理5分钟，并在4℃、16,400 × g下离心20分钟。上清液通过0.2 μm Duo - filter膜（日本京皆YMC Co., Ltd.公司）过滤。使用与TSQ Quantum Ultra质谱仪联用的Nanospace SI - 2 3033，以负离子模式通过液相色谱 - 串联质谱（LC - MS/MS）对硫酸吲哚酚和马尿酸进行定量分析。对于硫酸吲哚酚和马尿酸的测量，每个样品（1 μL）注入100 × 2.0 mm CAPCELL PAK C18 MG III，3 - μm柱（日本大阪OOSAKA SODA公司），配备Scherzo SM - C18保护柱5 × 2.0 mm（日本京皆Imtakt Corporation公司），流速为0.2 mL/分钟。对于梯度洗脱，流动相A为纯水中10 mM醋酸铵，流动相B为乙腈。线性和逐渐梯度法度如下：0 - 8分钟：0 - 100%溶剂B；8 - 12分钟：100%溶剂B；12 - 15分钟：0%溶剂B。通过MS/MS在选用反应监测（SRM）模式下进行定量分析，监测前体离子到居品离子的升沉和碰撞能量：硫酸吲哚酚的m/z 212 → 80，21 V；硫酸吲哚酚 - d4的m/z 216 → 80，30 V；马尿酸的m/z 178 → 134，13 V；马尿酸 - d5的m/z 183 → 139，27 V；对甲酚硫酸盐的m/z 187 → 107，23 V。喷雾电压为2500 V，汽化器温度为450℃，毛细管温度为220℃。

身段要素和领路功能

在M0和M12的血液透析法度放胆20分钟后，通盘患者经受横卧位，使用Seca®医用身段要素分析仪525（德国汉堡Seca GmbH & Co. KG公司）进行生物电阻抗分析。通过生物电阻抗分析评估的参数包括脂肪量、骨骼肌量、细胞外液（ECW）和总体液（TBW） 。在M0和M12对通盘患者进行浮浅精神状态查抄表（MMSE）查抄。

分析

变量凭证情况以平均值 ± 模范差（SD）或百分比（%）泄露。统计学权贵性设定为P < 0.05。组间比较经受配对t教育、非参数Wilcoxon象征秩教育和卡方教育。时刻进度分析经受重复测量方差分析和Bonferroni法进行多重比较。使用SPSS 22.0版（好意思国纽约州阿蒙克市IBM公司）进行统计分析，使用JMP Pro软件16.0.0版（好意思国北卡罗来纳州卡里市SAS Institute Inc.公司）进行GC - MS测量分析。

在代谢组学中，代谢物集富集分析用于识别与感酷好的表型（如疲困的存在）研究的改变的代谢物集（代谢道路），使用的算法基于行派别据库（在本研究中为京皆基因与基因组百科全书（KEGG））构建的通用代谢物汇集运行 。

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发布于：上海市